Microbiological Findings in Deep Caries Lesions

SUMMARY Introduction Caries is one of the most significant and widespread oral diseases. It has been confirmed that dental plaque, i.e. microorganisms in it, are the most important factor in the development of dental caries. Caries profunda represents deep carious lesion from where bacterial toxins may affect pulp through dentinal tubules. The aim of this study is to assess the efficacy of indirect pulp capping based on microbiological findings of bacteria present in deep carious lesions before and after the treatment. Material and Methods The clinical study included 29 patients of both genders, aged 16 to 40 and 45 permanent teeth with deep caries lesions. The first microbiological sample was taken after cavity preparation and removal of soft dentin from the bottom of the cavity. The second sample was taken after the removal of temporary filling and calcium hydroxide paste 60 days after the indirect pulp capping treatment. The collected samples were stored in special sterile micro tubes (Eppendorf) and kept at the temperature of −80°C until microbiological analysis was performed. Samples were tested for the presence of the following microorganisms: Porphyromonas gingivalis, Aggregatibacter actinomycetemcomitans and Enterococcus faecalis using the multiplex polymerase chain reaction (PCR) method. Results The results showed that prior to the treatment of deep carious lesions the most common species was E. faecalis (80% of samples), followed by A. actinomycetemcomitans (32% of samples), while the least common was P. gingivalis (16% of samples). After the treatment with products based on calcium hydroxide, E. faecalis was registered in 18% of samples, A. actinomycetemcomitans in 16% of samples and P. gingivalis was not registered in any sample. Conclusion The most common bacterial species in teeth with deep caries lesions was E. faecalis, whereas A. actinomycetemcomitans and P. gingivalis were found in lower number of samples.


INTRODUCTION
Dental caries is surely one of the most significant oral diseases and it is widespread both in children and adults [1,2,3].Caries profunda (deep caries lesion) is the place from where bacterial toxic agents through dentinal tubules can compromise pulp causing minor or major changes in it.If bacteria are removed or "captured" in the cavity after restoration caries lesion will stop spreading.Tubular sclerosis and tertiary dentin limit bacterial nutrition from pulp due to lower dentin permeability.It has also been known that microorganisms trapped in the cavity can change and become less pathogenic [4].
It has been confirmed that dental plaque (biofilm) and microorganisms in it are the most important factors in the development of dental caries.Due to the complex etiology and pathogenesis of this disease, its treatment still poses significant problem for most dental practitioners.In addition to S. mutans, Lactobacillus spp.and Actinomyces spp.pyogenic bacteria such as Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia and Aggregatibacter actinomycetemcomitans can be detected in dental plaque [5].
Viola et al. [6] analyzed saliva samples from children with and without present caries lesions and found that caries lesion starts when glucose glucan polymer (produced by S. mutans) forms a biofilm on teeth to which other oral bacteria, food debris and saliva components adhere.Ito et al. [7] using different methodology confirmed this finding.Do et al. [8] found that S. mutans is the most common cause of dental caries.Kouidhi et al. [9] in their study confirmed the presence of enterococci in the oral cavity of children in Tunisia.They isolated 33.9% of enterococci out of all positive cocci identified in oral cavity.55.8% of detected enterococci were isolated from carious lesions and only 2% were found in oral cavity of children who had no caries lesions.
In order to preserve pulp vitality and successfully treat deep caries lesions, timely and proper diagnosis is necessary as well as fast and efficient removal of carious dentin (as a primary reservoir of microorganisms), application of appropriate medications and sealed restoration [10].Pharmacological agents used in the treatment of deep caries lesions must eliminate remaining bacteria but also stimulate odontoblasts to produce tertiary dentin.Products based on calcium hydroxide are the most commonly used agents in the treatment of deep caries lesions although in the last few years the use of MTA is increasing with very high success rate [11].When applied at the bottom of clean cavity these materials stimulate odontoblasts to produce reparative dentin but also kill the remaining bacteria.
There is no consensus on the treatment of deep caries lesions.Some authors suggest complete removal of carious dentin prior to the application of medicaments while others recommend leaving a thin layer of dentin at the bottom of prepared cavity.Despite numerous achievements in modern dentistry and large number of pharmacological agents used in the treatment of caries profunda, successful treatment of deep caries lesions still depends on a number of factors [4,12,13,14].
The aim of this study is to assess the efficacy of indirect pulp capping based on microbiological findings in deep carious lesions before and after the treatment.

MATERIAL AND METHODS
The clinical study included 29 patients of both genders, age 16 to 40 years, who had deep caries lesions present based on medical history, clinical and radiographic examination of 45 teeth.Each patient had assigned a special card where personal data, teeth status, precise data on medication and materials, presence of bacteria in collected samples and subjective and objective changes during the treatment protocol were recorded.
The first microbiological samples were collected after cavity preparation and removal of soften dentin from the bottom of the cavity.Using sterile cotton swab and sterile forceps samples were collected from each caries lesion and then stored in special sterile micro tubes (Eppendorf) with 150 ml of carrier liquid and kept at -80°C until microbiological analysis.Using random selection method, after removing carious dentin calcium hydroxide agent (Dycal, DENTSPLY, Germany, or Calcipupe, Septodont, France) was applied and temporary filling placed (phosphate cement, Galenika, Serbia) for a period of two months.Two months later, the temporary filling and calcium hydroxide were removed from the cavity and from the bottom of the cavity another microbiological sample was taken with a sterile cotton swab and sterile forceps.
Bacterial DNA was isolated by treating the samples with proteinase K at the temperature of 56°C for 30 minutes, followed by enzyme inactivation by heating the samples at the temperature of 94°C for 15 minutes.Then after samples were kept at -20°C until PCR analysis was performed.The presence of the following microorganisms: Porphyromonas gingivalis, Aggregatibacter actinomycetemcomitans and Enterococcus faecalis was analyzed.For PCR analysis a known primer sequences were used.

RESULTS
The analysis of microorganisms in biological samples collected from 45 teeth (where the number of analyzed teeth per patient varied from 1 to 4) showed that the most common species was E. faecalis (80%), followed by A. actinomycetemcomitans (32%) while the least frequent was P. gingivalis (16%).
The existence of electrophoretic strips of the expected length on the polyacrylamide gel indicated positive result  for the tested species.Figure 1 shows gel with selected samples of E. faecalis.It is clear that one patient had E. faecalis detected in all 4 tested teeth (1a, 1b, 1c, 1d) but the 1d sample probably had smaller count of bacteria (PCR is only a semi-quantitative technique).Another patient (2a, 2b, 2c) also had this species detected in all three teeth.In one case (8a, 8b, 8c) E. faecalis was only detected in only one sample (8b).
Figure 2 shows a polyacrylamide gel with selected samples positive for A.actinomycetemcomitans.The level of amplification was fairly uniform which is uncommon for PCR reactions on bacteriological isolates from teeth.
More than one third of patients showed the presence of some of the tested bacteria (17 out of 29 patients) (Table 1).Three patients had co-infection of all three species E. faecalis, A. actinomycetemcomitans and P. gingivalis.Interestingly, all three patients were female.In addition, two patients had E. faecalis and A. actinomycetemcomitans and one patient had P. gingivalis and A. actinomycetemcomitans as well as E. faecalis and P. gingivalis.
Two months after the treatment of deep caries lesions the incidence of all three microorganisms in collected samples decreased significantly.The number of samples positive to E. faecalis (16%) and P. gingivalis (0%) was significantly lower that before the treatment (p<0.05), while the number of samples positive to A. Actinomycetemcomitans was not significantly different from before the treatment (Table 2).

DISCUSSION
Dental caries is one of the most significant and most widespread oral diseases.Due to its very complex etiology and pathogenesis, the treatment outcome is often uncertain.
Bjørndal et al. [15] in their study done on 314 patients at the Faculty of Dentistry in Copenhagen found that deep caries lesions more frequently affected posterior teeth compared to anterior teeth.In agreement with this study Ahmad et al. [1] revealed that out of 204 teeth with deep caries lesions 21 teeth were incisors and 183 were posterior teeth.
Maeda et al. [16] investigated the influence of oral streptococci and lactobacilli on pH levels in active caries lesions on 24 extracted human molars and concluded that pH value of carious dentin was lower than pH value of intact dentin.They also concluded that there was a significant correlation between decreasing pH and demineralization in active caries lesions.Using the PCR method and pH imaging microscope, Maeda et al. found that the lowest pH value was registered in dentin samples affected by active caries lesions where S. mutans and other oral bacteria were detected.In 7 out of 8 samples with the lowest pH, the authors detected S. mutans only, which is the most important species in forming biofilm and starting dentin destruction [16].
Estrela et al. [11] examined the effect of several agents used in the treatment of deep caries lesions.They found that MTA, Portland cement, Dycal, calcium hydroxide paste and Sealapeax have antibacterial effect against several bacterial species (Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus) and fungi (Candida albicans).After two-day incubation period calcium hydroxide paste showed the best antimicrobial effect (inhibition zone was 6 to 9.5 mm and diffusion zone 10-18 mm).Results for Dycal showed no inhibition zone, nor diffusion zone, which indicated weak antimicrobial activity.In 2010 Parolia et al. [12] in their study on 36 premolars confirmed the results of previous authors.Good adhesion to the walls of the cavity physically prevents penetration of bacteria toward the pulp and is an important prerequisite for the success of the indirect pulp capping treatment.However, as there is no material that provides an adequate marginal seal, it is very important that restorative procedure uses materials with good adhesive properties and restoration techniques that will ensure good adhesive bond of material with the cavity walls.
Pyogenic bacteria such as P. gingivalis, P. intermedia and A. actinomycetemcomitans have also been detected in dental plaque [18,19].In addition to the anaerobic cultivation of microorganisms, PCR techniques (such as hybridization technique) have been used for bacterial identification [5].Martin et al. [20] using PCR method performed microbiological analysis of 65 teeth with deep caries lesions and inflamed pulp and found that anaerobic bacteria play an important role in development of caries lesions and endodontic infections.Kneist et al. [21] analyzed bacteria found in caries lesions of primary teeth after chemical-mechanical method (CARISOLV™ system) was used for caries removal.They found that number of bacteria in deep caries lesions was significantly higher than in superficial lesions (caries media).Also, their study showed that most commonly found bacteria in prepared cavity were oral streptococci (S. mutans, S. intermedia etc.) then Actinomyces spp.and Lactobacillus spp.[21].
Aas et al. [22] conducted a study on 90 patients (51 with deep caries lesions and diagnosed pulpitis).Microbiological and PCR methods reveled the presence of anaerobic bacteria while Veillonella, Lactobacillus, Bifidobacterium and Propionibacterium, Actinomyces spp., and Atopobium spp, with S. mutans, played an important role in the progression of caries lesions.Using PCR method on 20 samples of dental plaque in subjects of different ages (children aged 5 to 6 and adults), Cheon et al. [23] found that large number of genotypes of S. mutans (ranging from 1.6 to 2.4) were more prevalent in children than in adults.
Duque et al. [24] examined the effects of glass ionomer cement (Fuji) and Dycal in the treatment of deep caries lesions in 27 permanent molars.PCR method confirmed the presence of S. mutans and Lactobacillus spp.before and 3 months after the treatment of deep caries lesions.However, there was a significant reduction in the number of these bacteria after completed treatment.
It has been confirmed that 90% of enterococcal infections in humans are caused by E. faecalis.This species can survive in extremely difficult conditions, as it is adaptable to different environmental conditions.It can also become resistant to the lethal dose of hydrogen peroxide, ethanol and pH changes.Studies of Perez et al. [25] and Love et al. [26] showed that E. faecalis can be found in dentinal tubules of teeth with caries lesions.Kayaoglu and Ørstavik [27] pointed out the significance of E. faecalis in the occurrence of endodontic disease and periapical inflammation.Kolenbrander et al. [28] found A. actinomycetemcomitans and P. gingivalis to be one of the most significant bacteria in the development of caries lesions [26].Gomez et al. [29] examined the efficacy of chlorhexidine and calcium hydroxide against E. faecalis and found that chlorhexidine completely inhibited its growth while calcium hydroxide had no effect.
The most commonly detected species in caries lesions prior to the treatment in the current study was E. faecalis, followed by A. actinomycetemcomitans while the least common was P. gingivalis.After the treatment with calcium hydroxide products, there was a significant reduction in the number of E. faecalis and A. actinomycetemcomitans, while P. gingivalis was not detected in any samples.This can be explained by the fact that E. faecalis was probably effectively mechanically removed using burs or it diffused into dentinal tubules.Another reason why it was not detected could be a good marginal seal achieved with phosphate cement after application of calcium hydroxide medicaments during 60 days.Considering that medicaments based on calcium hydroxide do not have killing effect on E. faecalis, its decrease was probably due to the correct mechanical removal of caries and good restorative filling done by the same practitioner in adequate clinical conditions.Remaining E. faecalis in deeper layers of dentinal tubules and inefficient removal of carious dentin may be reasons for failure of indirect pulp capping, which consequently can lead to inflammation of the pulp and need for endodontic treatment.

UVOD
Ka ri jes je si gur no jed no od naj zna čaj ni jih obo lje nja usne du plje i ši ro ko je ras pro stra nje no i kod de ce i kod od ra slih [1,2,3].Ca ri es pro fun da (du bo ki kvar zu ba) je me sto oda kle bak te rijsko-tok sič ni agen si pre ko den tin skih ka na li ća ugro ža va ju pul pu, uslo vlja va ju ći ma nje ili ve će pro me ne u njoj.Mo guć nost za u stavlja nja da ljeg ši re nja le zi je po sto ji uko li ko se bak te ri je uklo ne ili "za ro be" u ka vi te tu na kon re sta u ra ci je.Tu bu lar na skle ro za i ter ci jar ni den tin ih mo gu izo lo va ti jer je spre če na nji ho va moguć nost is hra ne iz pul pe zbog ma nje per me a bil no sti den ti na.Po zna to je ta ko đe da za ro blje ni mi kro or ga ni zmi u ka vi te tu mo gu da se me nja ju i da pri tom po sta ju ma nje pa to ge ni [4].
Da nas je si gur no da su den tal ni plak (bi o film), od no sno mi kro or ga ni zmi ko ji se na la ze u nje mu, naj va žni ji fak tor nastan ka ka ri je sa.Zbog vr lo kom plek sne eti o lo gi je i pa to ge ne ze ovog obo lje nja, nje go va te ra pi ja je i da lje zna ča jan pro blem za ve ći nu sto ma to lo ga prak ti ča ra.U zub nom pla ku je osim Strepto coc cus mu tans, Lac to ba cil lus spp.i Ac ti nomyces spp.mo gu će ot kri ti i pri su stvo pi o ge nih bak te ri ja, kao što su Porphyro mo nas gin gi va lis, Pre vo tel la in ter me dia i Aggregatibacter ac ti nomycetem co mi tans [5].
Vi o la (Vi o la) i sa rad ni ci [6] su u svo joj stu di ji, na osno vu uzo ra ka iz plju vač ke uze tih od de ce s ka ri je snim le zi ja ma i bez ovih le zi ja, utvr di li da ka ri jes za po či nje on da ka da glu kan-poli mer glu ko ze (stva ra ga S. mu tans) for mi ra na po vr ši ni zu ba bi o film na ko ji pri a nja ju oral ne bak te ri je, osta ci hra ne i kompo nen te iz plju vač ke.Do istog za ključ ka su do šli i Ito (Ito) i sa rad ni ci [7] bez ob zi ra na dru ga či ju me to do lo gi ju to kom istra ži va nja.Do (Do) i sa rad ni ci [8] su utvr di li da je S. mu tans naj če še ći uzroč nik na stan ka den tal nog ka ri je sa.Ku i di (Ko u id hi) i sa rad ni ci [9] su u svo jim is ka zi ma po tvr di li pri su stvo en tero ko ku sa u usnoj du plji de ce u Tu ni su.Oni su izo lo va li 33,9% en te ro ko ku sa od svih po zi tiv nih ko ka iden ti fi ko va nih iz oral ne du plje, pri če mu je 55,8% en te ro ko ku sa izo lo va no iz ka ri je snih le zi ja, a sa mo 2% iz usne du plje de ce bez ka ri je sa.
Za oču va nje vi ta li te ta pul pe i uspe šnu te ra pi ju du bo kog kari je sa neo p hod ni su pra vo vre me na i pra vil na di jag no za, br zo i efi ka sno ukla nja nje ka ri je sno pro me nje nog den ti na (kao osnovnog re zer vo a ra mi kro or ga ni za ma), pri me na od go va ra ju ćih medi ka me na ta i kva li tet na re sta u ra ci ja ka vi te ta [10].Me di ka ment na sred stva ko ja se ko ri ste u le če nju du bo kog ka ri je sa ima ju za da tak da de lu ju na za o sta le mi kro or ga ni zme, ali i da sti mu li šu odonto bla ste na stva ra nje ter ci jar nog den ti na.Pre pa ra ti na ba zi kal cijum-hi drok si da su naj če šće ko ri šće na sred stva u le če nju du bo kog ka ri je sa iako se po sled njih go di na u ove svr he sve vi še ko ri sti i MTA s vr lo vi so kim pro cen tom uspe šno sti [11].Apli ko va ni na dno pre pa ri sa nog ka vi te ta, ovi ma te ri ja li sti mu li šu odon to bla ste na pro iz vod nju re pa ra tiv nog den ti na, ali de lu ju i an ti bak te rij ski na za o sta le mi kro or ga ni zme u tan kom slo ju sa ču va nog den ti na.
Mi šlje nja auto ra o te ra pi ji du bo kog ka ri je sa i da nas su po delje na.Jed ni sma tra ju da je pre pri me ne me di ka ment nih sredsta va neo p hod no pot pu no uklo ni ti ka ri je sno pro me nje ni dentin, dok dru gi za go va ra ju pri stup sa de li mič nim ukla nja njem raz mek ša log den ti na, te osta vlja njem tan kog slo ja den ti na na dnu pre pa ri sa nog ka vi te ta.Bez ob zi ra na ve li ki na pre dak moder ne sto ma to lo gi je i ve li ki broj me di ka ment nih sred sta va ko ji se da nas ko ri ste u le če nju ka ri je sa, te ra pi ja du bo kog ka ri je sa se i da lje sma tra slo že nim po stup kom či ji uspeh za vi si od broj nih fak to ra [4,12,13,14].
Cilj ovog is tra ži va nja bio je da se na osno vu mi kro bi o lo ške ana li ze bak te ri ja u ka ri je snoj le zi ji, pre i po sle te ra pi je, od no sno na osno vu kli nič kih is tra ži va nja, pro ve ri efi ka snost le če nja du bokih ka ri je snih le zi ja po stup kom in di rekt nog pre kri va nja pul pe.

MATERIJAL I METODE RADA
Kli nič ko is tra ži va nje je ob u hva ti lo 29 pa ci je na ta oba po la, uzra sta od 16 do 40 go di na, kod ko jih je na osno vu anam ne ze, kli nič kog i ra di o graf skog pre gle da 45 zu ba di jag no sti ko van du bo ki ka ri jes.Za evi den ti ra nje do bi je nih po da ta ka ovog istra ži va nja na pra vljen je po se ban kar ton za sva kog pa ci jen ta, gde su upi sa ni lič ni po da ci, po da ci o sta nju zu ba i pre ci zni poda ci o le ko vi ma i ma te ri ja li ma, za stu plje no sti bak te ri ja u uze tim bri se vi ma, od no sno o su bjek tiv nim i objek tiv nim pro me na ma to kom te ra pij skog pro to ko la.
Po sle pre pa ra ci je ka vi te ta i ukla nja nja raz mek ša log den ti na, sa dna ka vi te ta je uzet pr vi uzo rak za mi kro bi o lo šku ana li zu.Uzo rak je uzet ste ril nom ku gli com va te i ste ril nom pin ce tom, a po tom od lo žen u po seb ne ste ril ne mi kro tu bi ce (epen dor fe) sa 150 ml tran sport ne teč no sti i ču van na tem pe ra tu ri od -80°C do mi kro bi o lo ške ana li ze.Me to dom slu čaj nog iz bo ra kod pa ci jen ta je u oči šćeni ka vi tet apli ko va no sred stvo na ba zi kal ci jum-hidrok si da (Dycal, DENTSPLY, Ne mač ka, ili Cal ci pul pe, Sep todont, Fran cu ska), a po tom je ka vi tet is pu njen ma te ri ja lom za pri vre me no za tva ra nje (fos fat nim ce men tom, Ga le ni ka, Sr bi ja) to kom dva me se ca.Na kon dva me se ca iz ka vi te ta su uklo nje ni pri vre me ni is pun i pre pa rat na ba zi kal ci jum-hi drok si da, a sa dna ka vi te ta uzet je dru gi mi kro bi o lo ši uzo rak ste ril nom va ticom i ste ril nom pin ce tom.
Izo la ci ja even tu al no pri sut ne bak te rij ske DNK vr še na je treti ra njem uzo ra ka pro te i na zom K na tem pe ra tu ri od 56°C to kom 30 mi nu ta, na kon če ga je sle di la inak ti va ci ja en zi ma za gre ja vanjem uzo ra ka na tem pe ra tu ri od 94°C to kom 15 mi nu ta.Ta ko pri pre mlje ni ma te ri jal ču van je na -20°C do kom plet ne PCR ana li ze.Uzor ci ma te ri ja la su is pi ta ni na pri su stvo sle de ćih mikro or ga ni za ma: Porphyro mo nas gin gi va lis, Ag gre ga ti bac ter acti nomyce tem co mi tans i En te ro coc cus fa e ca lis.Za iz vo đe nje PCR re ak ci je ko ri šće ne su po zna te se kven ce praj me ra.

REZULTATI
Ana li za mi kro or ga ni za ma u bi o lo škom ma te ri ja lu uze tom iz 45 zu ba (pri če mu je broj ana li zi ra nih zu ba po pa ci jen tu va rirao od 1 do 4) po ka za la je da je naj če šći bio E. fa e ca lis (80%), po tom A. ac ti nomyce tem co mi tans (32%), dok je naj re đi bio P. gin gi va lis (16%).
Po sto ja nje elek tro fo ret skih tra ka oče ki va ne du ži ne na po lia kri la mid nom ge lu ozna ča va lo je po zi ti van na laz za is pi ti va nu bak te ri ju.Na sli ci 1 pri ka zan je gel sa oda bra nim uzor ci ma E. fa e ca lis.Ja sno se vi di da je kod jed nog pa ci jen ta ova bak te ri ja ot kri ve na u sva če ti ri ana li zi ra na zu ba (1a, 1b, 1c, 1d), s tim da je u uzor ku 1d ve ro vat no bi la ne što re đa (PCR je sa mo se mikvan ti ta tiv na teh ni ka).Kod dru gog pa ci jen ta (2a, 2b, 2c) u sva tri is pi ta na zu ba ta ko đe je ot kri ve na ova bak te ri ja, dok je kod jed nog pa ci jen ta (8a, 8b, 8c) uoče na sa mo u uzor ku 8b.
Na sli ci 2 pri ka zan je po li a kri la mid ni gel s oda bra nim uzorci ma po zi tiv nim na A. ac ti nomyce tem co mi tans.Ni vo am pli fi kaci je je bio pri lič no ujed na čen u ve ći ni uzo ra ka, što je re la tiv no ne u o bi čaj no za PCR re ak ci je na bak te rij skim izo la ti ma iz zu ba.
Ako se po sma tra in ci den ci ja in fek ci ja, kod 17 pa ci je na ta ot kri ve na je bar jed na is pi ti va na bak te ri ja (Ta be la 1).Kod tri pa ci jen ta usta no vlje na je ko in fek ci ja sve tri bak te ri je.Za nimlji vo je da su sva tri pa ci jen ta bi la žen skog po la.Ta ko đe, kod dva pa ci jen ta usta no vlje ne su isto vre me no E. fa e ca lis i A. ac tinomyce tem co mi tans, dok su kod po jed nog pa ci jen ta za be le že ni isto vre me no P. gin gi va lis i A. ac ti nomyce tem co mi tans, kao i E. fa e ca lis i P. gin gi va lis.
Ana li za po sto ja nja mi kro or ga ni za ma u bri se vi ma na kon prime nje ne te ra pi je po ka za la je da se uče sta lost sve tri bak te ri je zna čaj no sma nji la.Kod E. fa e ca lis (16%) i P. gin gi va lis (0%) to sma nje nje je bi lo vi so ko sta ti stič ki zna čaj no (p<0,05), dok kod A. ac ti nomyce tem co mi tans ni je bi lo (Ta be la 2).

DISKUSIJA
Ka ri jes je jed no od naj zna čaj ni jih i naj ra spro stra nje ni jih obo ljenja usne du plje.Zbog nje go ve vr lo slo že ne eti o lo gi je i pa to ge neze, le če nje je i da lje zna ča jan pro blem i če sto s vr lo ne iz ve snim is ho dom.
Bjor ndal (Bjør ndal) i sa rad ni ci [15] su u svome is tra ži va nju iz ve de nom na 314 pa ci je na ta na Sto ma to lo škom fa kul te tu u Ko pen ha ge nu utvr di li da su zu bi boč nog seg men ta bi li če šće za hva će ni du bo kim ka ri je som u od no su na fron tal ne zu be.S pret hod nim is tra ži va njem su se slo ži li i Ah mad (Ah mad) i sarad ni ci [1], ko ji su re a li zo va li is tra ži va nje na 204 zu ba sa dubo kim ka ri je som (21 zub su či ni li se ku ti ći, a 183 zu bi boč nog seg men ta).
Ma e da (Ma e da) i sa rad ni ci [16] su is pi ti va li uti caj oral nih strep to ko ka i lak to ba ci la na ni vo pH u ak tiv noj ka ri je snoj le ziji kod 24 eks tra ho va na hu ma na mo la ra in fi ci ra na ka ri je som i za klju či li da je pH vred nost den ti na za hva će nog ka ri je som bi la ni ža od pH vred no sti in takt nog den ti na.Ta ko đe su za klju či li da po sto ji zna čaj na ko re la ci ja iz me đu sni že nja pH vred no sti i de mi ne ra li za ci je u ak tiv nim ka ri je snim le zi ja ma.Ko ri ste ći PCR me to du i pH-imi džing mi kro skop, ovi auto ri su utvr di li da je naj ni ža pH vred nost re gi stro va na u uzor ci ma den ti na za hvaće nim ak tiv nim ka ri je snim le zi ja ma u ko ji ma su ot kri ve ni S. mu tans i ve li ki broj dru gih oral nih bak te ri ja.U se dam od osam uzo ra ka s naj vi šim pH vred no sti ma auto ri su za be le ži li po sto janje sa mo S. mu tans, ko ji for mi ra bi o film i za po či nje den tin sku de struk ci ju za jed no sa dru gim bak te ri ja ma ko je stva ra ju ak tivnu ka ri je snu le zi ju [16].
Estre la (Estre la) i sa rad ni ci [11] su is pi ti va li dej stvo ne ko li ko le ko va ko ji se ko ri ste u te ra pi ji du bo kog ka ri je sa.Is tra žu ju ći anti mi krob ni efe kat MTA, Por tland ce men ta, Dycal, pa ste na ba zi kal ci jum-hi drok si da, i Se a la pe ax na ne ko li ko vr sta bak te ri ja (En te ro coc cus fa e ca lis, Pse u do mo nas aeru gi no sa, Ba cil lus subti lis, Staphylo coc cus aure us) i glji vi cu (Can di da al bi cans).Po sle dvo dnev nog in ku ba ci o nog pe ri o da usta no vi li su da je pa sta na ba zi kal ci jum-hi drok si da ima la naj ve će an ti mi krob no dej stvo i naj bo lji te ra pij ski uči nak (iz me re na zo na in hi bi ci je je bi la 6-9,5 mm, a zo na di fu zi je 10-18 mm).Re zul ta ti za pa stu Dycal su po ka za li da ni je bi lo ni zo ne in hi bi ci je, ni ti zo ne di fu zi je, što je uka zi va lo na sla bo an ti mi krob no dej stvo.Pa ro li ja (Pa ro lia) i sa rad ni ci [12] su u svo me is tra ži va nju na 36 pre mo la ra ta ko đe po tvr di li re zul ta te pret hod nih auto ra.
Do bro pri a nja nje ma te ri ja la za zi do ve ka vi te ta fi zič ki spreča va pro dor bak te ri ja ka pul pi i va žan je pred u slov za uspeh le če nja in di rekt nog pre kri va nja pul pe.Me đu tim, s ob zi rom na to da da nas ne po sto ji ni je dan ma te ri jal ko ji obez be đu je od gova ra ju će rub no za tva ra nje, ve o ma je va žno da se u re sta u ra tiv noj pro ce du ri ko ri ste ma te ri ja li sa do brim ad he ziv nim svoj stvi ma i teh ni ke re sta u ra ci je ko je će obez be di ti do bru ad he ziv nu ve zu ma te ri ja la sa zi do vi ma ka vi te ta.
U zub nom pla ku je ta ko đe mo gu će ot kri ti pi o ge ne bak te rije, kao što su Porphyro mo nas gin gi va lis, Pre vo tel la in ter me dia i Aggregatibacter ac ti nomyce tem co mi tans [18,19].Po red anae rob nog kul ti vi sa nja mi kro or ga ni za ma pri me nju ju se i te sto vi za ot kri va nje nji ho vih an ti ge na, kao što je teh ni ka hi bri di zaci je, od no sno PCR me to da iden ti fi ka ci je, ko ja je ko ri šće na i u ovom ra du [5].Is tra ži va nja Mar ti na (Mar tin) i sa rad ni ka [20] na 65 zu ba sa du bo kim ka ri je snim le zi ja ma i upa lje nom pul pom po ka za la su (na osno vu PCR me to de) da ana e rob ne bak te ri je ima ju va žnu ulo gu u na stan ku ka ri je sa i en do dont ske in fek ci je.Knajst (Kne ist) i sa rad ni ci [21] su ukla nja li ka ri je sne ma se na mleč nim zu bi ma he mo me ha nič kom me to dom (CA RI SOLV TM si ste mom) a za tim uzi ma li bris sa dna ka vi te ta za mi kro bi o lošku ana li zu.Utvr di li su da je broj bak te ri ja kod du bo kog ka rije sa znat no ve ći ne go u bri se vi ma uze tim iz pli ćih ka ri je snih de struk ci ja (ca ri es me dia).Oni su ta ko đe iden ti fi ko va li bakte rij ske so je ve u pre pa ri sa nom ka vi te tu, gde su naj če šće bi le oral ne strep to ko ke (S. mu tans, S. in ter me dia itd.), za tim vr ste ro da Ac ti nomyces, kao i vr ste ro da Lac to ba cil lus [21].
As (Aas) i sa rad ni ci [22] su iz ve li is tra ži va nje kod 90 is pi ta ni ka (51 sa du bo kim ka ri je som i di jag no sti ko va nim pul pi ti som).Za seja va njem na bak te rij skim kul tu ra ma i PCR me to dom pro ce ni li su uče sta lost ana e rob nih bak teri ja i za klju či li da bak te ri je Ve il lo nel la, Lac to ba cil lus, Bi fi do bac te ri um i Pro pi o ni bac te ri um, Ac ti nomyces spp.i Ato po bi um spp, uz S. mu tans, ima ju va žnu ulo gu u raz vo ju ka ri je sa.Čeon (Cheon) i sa rad ni ci [23] su ko ri ste ći PCR me to du na 20 uzo ra ka den tal nog pla ka kod is pi ta ni ka raz li či te sta ro sne do bi (de ce uz ra sta od pet do šest go di na i od ra slih) za klju či li da je ve ći broj ge no ti po va bak te ri je S. mu tans (u ra spo nu od 1,6 do 2,4) bio če šći kod de ce ne go kod od ra slih is pi ta ni ka.Dik (Du que) i sa rad ni ci [24] su is pi ti va li efek te gla sjo no merce men ta (Fu ji) i pa ste Dycal u te ra pi ji du bo kog ka ri je sa na 27 stal nih mo la ra.Pri me nom PCR me to de utvr đe ne su bak te rij ske vr ste S. mu tans i Lac to ba cil lus pre i tri me se ca po sle le če nja du bo kog ka ri je sa.Utvr đe no je zna čaj no sma nje nje bro ja ovih bak te ri ja u uzor ci ma.
Po tvr đe no je da je 90% en te ro kok nih in fek ci ja kod čo ve ka iza zva no s E. fa e ca lis.Ova bak te ri ja mo že da pre ži vi u eks tremno te škim uslo vi ma, jer se mo že pri la go di ti raz li či tim uslo vi ma sre di ne.Ona po sta je ma nje ose tlji va na le tal ne do ze vo do nik-pe rok si da i eta no la, te na pro me ne pH sre di ne.Stu di je Pe re za (Pe rez) i sa rad ni ka [25] i La va (Lo ve) i sa rad ni ka [26] su po kaza le da se E. fa e ca lis na la zi u den tin skim tu bu li ma zu ba s ka rije snim le zi ja ma, što je je dan od raz lo ga iz vo đe nja i na še stu di je.Ka ja o glu (Kayaoglu) i Or sta vik (Ør sta vik) [27] su uka za li na ve li ki zna čaj E. fa e ca lis u na stan ku en do dont skih obo lje nja i peri a pi kal nih za pa lje nja.Ko len bran der (Ko len bran der) i sa rad ni ci [28] su is pi tu ju ći bak te ri je u den tal nom pla ku (bi o fil mu), kao jed nom od naj zna čaj ni jih fak to ra u na stan ku ka ri je sa, uoči li i po sta ja nje A. ac ti nomyce tem co mi tans i P. gin gi va lis.Go mez (Go mez) i sa rad ni ci [29] su is pi tu ju ći uti caj hlor hek si di na i kalci jum-hi drok si da na 180 in takt nih go ve đih zu ba in fi ci ra nih sa E. fa e ca lis za klju či li da hlor hek si din pot pu no in hi bi ra rast ove bak te ri je, dok kal ci jum-hi drok sid ni je imao uti ca ja na njen rast.
Ana li za bri se va uze tih od pa ci je na ta u ovom is tra ži va nju pre po čet ka le če nja po ka za la je da je naj če šća bak te ri ja bi la E. fa e ca lis, za tim A. ac ti nomyce tem co mi tans i P. gin gi va lis.Na kon pri me nje ne te ra pi je pre pa ra ti ma na ba zi kal ci jum-hi drok sida, do šlo je do zna čaj nog sma nje nja bro ja E. fa e ca lis i A. ac tinomyce tem co mi tans u tre ti ra nim uzor ci ma, dok P. gin gi va lis ni je za be le žen ni u jed nom uzor ku.Ovo sma nje nje bro ja bak te ri je E. fa e ca lis mo že se ob ja sni ti či nje ni com da je E. fa e ca lis ve ro vat no efi ka sno me ha nič ki uklo njen ro ti ra ju ćim in stru men ti ma ili je di fun do vao u den tin ske tu bu le.Dru gi raz log što ni je uočen na dnu ka vi te ta mo gao bi bi ti do bro rub no za tva ra nje fos fat nim ce men tom na kon pri me ne me di ka men ta na ba zi kal ci jum-hidrok si da to kom 60 da na.S ob zi rom na to da pre pa ra ti na ba zi kal ci jum-hi drok si da ne ma ju iz ra zit efe kat na E. fa e ca lis, nje go vo sma nje nje je ve ro vat no po sle di ca ko rekt nog me ha nič kog ukljanja nja ka ri je snih ma sa i do brog re sta u ra tiv nog is pu na ko je je re a li zo vao isti te ra pe ut u od go va ra ju ćim kli nič kum uslo vi ma.Za o sta ja nje E. fa e ca lis u du bljim slo je vi ma den tin skih tu bu la i ne e fi ka sno uklja nja nje ka ri je sa mo gu bi ti i raz log ne u spe ha in di rekt nog pre kri va nja pul pe, što po sle dič no mo že do ve sti do upa le pul pe i zah te va za en do dont skom in ter ven ci jom na obole loj pul pi.

ZAKLJUČAK
Pre po čet ka le če nja du bo kih ka ri je snih le zi ja naj če šća bak te ri ja je bi la E. fa e ca lis, po tom A. ac ti nomyce tem co mi tans, dok je najre đa bi la P. gin gi va lis.Na kon pri me nje ne te ra pi je in di rekt nog pre kri va nja pul pe, E. fa e ca lis i A. ac ti nomyce tem co mi tans su zabe le že ni u zna čaj no ma njem bro ju, a P. gin gi va lis ni je otkriven ni u jed nom uzor ku.

Figure 2 .
Figure 2. PAA gel with the PCR products of 10 teeth samples collected from ten patients.The strip at a height of 660 base pairs (bp) corresponds to Aggregatibacter actinomycetemcomitans.Sli ka 2. PAA gel sa PCR pro iz vo di ma 10 uzo ra ka zu ba po re klom od de set pa ci je na ta.Tra ka na vi si ni od 660 ba znih pa ro va (bp) od go va ra bak te ri ji Ag gre ga ti bac ter ac ti nomyce tem co mi tans.

Figure 1 .
Figure 1.PAA gel with PCR results of 10 samples from three patients.The strip at hight of 400 base pairs (bp) corresponds to Enterococcus faecalis.Sli ka 1. PAA gel sa PCR pro iz vo di ma 10 uzo ra ka po re klom od tri pa ci jen ta.Tra ka na vi si ni od 400 ba znih pa ro va (bp) od go va ra bak te ri ji En te ro coc cus fa e ca lis.

Table 1 .
Presence of the three tested microorganisms in collected samples Ta be la 1. Uče sta lost tri is pi ti va na mi kro or ga ni zma kod pa ci je na ta Pg -Porphyromonas gingivalis, Aa -Aggregatibacter actinomycetemcomitans;Ef -Enterococcus faecalis F -female; M -male Ž -ženski; M -muški Table2.Presence of certain microorganisms before and after applied treatment Ta be la 2. Uče sta lost po je di nih mi kro or ga ni za ma pre i po sle prime nje ne te ra pi je